荧光定量PCR 实验步骤（1） 

样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，上海lncRNA荧光定量PCR技术服务，上海lncRNA荧光定量PCR技术服务，室温放置5分钟使其完全溶解。

②每样品加入1ml的TRIZOL试剂裂解，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块，上海lncRNA荧光定量PCR技术服务。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用移液器反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）指的是在PCR进行的同时，对其过程进行监测的能力（即实时）。因此，数据可在PCR扩增过程中，而非PCR结束之后，进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了**性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中，反应以循环中***检测到目标扩增的时间点为特征，而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的***增加。相反，终点法检测（也称 “读板检测”）测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。

浓度测定

  A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：

  RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21

  RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

  取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：

  35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

  RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

  2)变性琼脂糖凝胶电泳测定

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