问题及其解答：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？1、抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是**重要的一条。2、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3、内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4，上海四色免疫组化染色服务、非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5、DAB孵育时间过长或浓度过高；6、PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤为重要；7、标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。我的实际解决方案：以上的分析可能对于初学者还是不容易的，下面我就把我的排除实验的具体过程与大家进行分享、交流和讨论。1、首先排除抗体孵育条件。一般来说，上海四色免疫组化染色服务，着色效果的好坏与抗体的孵育条件是密不可分的，由于用SP法已经做出来过一次且效果不错，因此对于同样组织的同一抗原进行分析，这种因素可以先排除，上海四色免疫组化染色服务。2、其次，DAB孵育时间是否太长？做出来那一次我是孵育8min，后来也是8-10min。

    6、Indo-1Indo-1是典型的双发射荧光探针，无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。7、量子点(quantumdot)量子点是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。8、辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶是一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故得名。它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。该酶比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以较为常用，不但可以用于免疫组化染色，也***运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。

    ·目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。(2)碱性磷酸酶(AP)及底物·AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：–偶氮偶联反应，底物为-萘酚磷酸盐，经水解后得-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fastblue)或坚牢红(fastred)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。–靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodylphosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。2、常用的免疫酶染色方法·又分为以下两种方法：–酶标抗体法·直接法·间接法–非标记抗体酶法·酶桥法·PAP法(1)酶标抗体法·通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。–优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。–缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。(1)酶标抗体法——直接法·将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，***用底物显色剂显色。(1)酶标抗体法——间接法·将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合。

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