为了在同一张组织切片或细胞学涂片上同时或先后显示两种或两种以上的抗原，发展了双重和多重免疫组化技术。这对于在原位了解不同抗原的关系，将形态与功能相结合极为有用。

  近年来，双重标记技术结合了免疫组化和核酸分子杂交技术，已跨越蛋白质水平，进入DNA、RNA水平，上海五色免疫组化实验服务，可在同一细胞内显示两种不同的DNA或mRNA，上海五色免疫组化实验服务，或者显示DNA和蛋白质。也有人以放射性同位素标记和酶组织化学结合来显示靶DNA和抗原。双重染色的基本方法有双重荧光和双重酶标记法，上海五色免疫组化实验服务。双重荧光标记**常用的是FITC和TMRITC或RB200，双重酶标记常用的是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

    pH)漂洗5min×3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。·缓冲甘油封片–分析纯无荧光的甘油9份+pH，。·镜检：在荧光显微镜下观察。·优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。·缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。直接免疫荧光法的注意事项·对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；·一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。直接免疫荧光法的注意事项(续)·染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；–染色时间：从10min到数小时，一般30min；–染色温度：多采用室温(25C)，高于37C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎***)可采用0-2C的低温，延长染色时间。–低温染色过夜较37C30min效果好的多。直接免疫荧光法的注意事项(续)·试验时需设置下列对照：–自发荧光对照(空白对照)：标本加，。–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。–特异性对照(***试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

    用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4℃避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。7）血清封闭组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min。但也要防止封闭过度8）一抗和二抗浓度和孵育时间一抗孵育条件在免疫组化反应中**重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果比较好；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37℃30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4℃比较好，反应温和，但时间比较好超过16~24h。

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