荧光定量PCR实验步骤：

  取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

  两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层，天津食品安全荧光定量PCR技术服务。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

  RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，天津食品安全荧光定量PCR技术服务，天津食品安全荧光定量PCR技术服务，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

TaqMan探针法：TaqMan 探针法是具有高度特异性的定量 PCR 技术。它的工作原理是在 PCR 反应体系中存在一对 PCR 引物和一条探针，探针的5′ 端标记有报告基团，3′ 端标记有荧光淬灭基团，探针只与模板特异结合，其结合位点在两条引物之间。当探针完整的时候，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，所以仪器搜集不到信号，随着反应的进展，Taq酶遇到探针，利用 3′→5′ 外切核酸酶的活性把探针切断，导致报告基团的荧光能量不能被淬灭基团吸收，产生了荧光信号，因此信号的强度就**了模板 DNA 的拷贝数

管家基因反应体系： 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 内参照上游引物F 0.5μl 3 内参照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待测样品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

  制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

  反应体系： 序号 反应物 剂量 1 10×PCR缓冲液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

  35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72℃延伸5分钟。

  PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

  将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。

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