多重荧光免疫组化与显色法多重免疫组化不同，多重荧光免疫组化（mIHC）是基于酪胺信号放大（ Tyramide Signal Amplification，北京六色免疫组化技术服务，TSA）技术，可实现在同一组织切片样本上对多个靶标进行区别标记，进而分析组织微环境中蕴含的复杂信息，北京六色免疫组化技术服务，北京六色免疫组化技术服务。 多靶标组织原位的定位，半定量分析，数据更有价值高清共染图片，助力高水平文章发表大幅提升低丰度蛋白的检出几率节省抗体用量，节约宝贵时间同一来源种属抗体的多重标记，无需更换经典克隆节约珍贵样本，小切片提供大信息。

    ·免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1混合乳化后(油包水)注入动物。–一般***注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。佐剂与抗原乳化的方法·研磨法：适于制备大量的佐剂抗原–先将不完全佐剂加热，取；缓缓滴入，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。–按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。·缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。佐剂与抗原乳化的方法(续)·注射器混合法–将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。·优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。·缺点：不易乳化，时间长。佐剂与抗原乳化的方法(续)·快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。–将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下，离瓶底，以免打碎离心管。–每次乳化10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。·优点：简单、快速、节省材料。

    3、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。比较大激发光波长为550nm；比较大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。4、花青类染料常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。5、乙酸甲酯其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用**多的细胞内pH荧光指示剂。比较大激发光波长为505nm，比较大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。

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