·若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。直接免疫荧光法的注意事项(续)·一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；·经荧光染色的标本比较好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降，江苏七色免疫组化分析服务。(2)间接法又称为荧光抗-抗体法需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)，江苏七色免疫组化分析服务。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。–可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。间接免疫荧光法操作步骤·标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；·一抗染色：–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用)，37C作用30min或4C过夜，江苏七色免疫组化分析服务。·PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；间接免疫荧光法操作步骤(续)·加荧光标记的二抗抗体，37C湿盒避光作用30min。·PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；·甘油缓冲液封片·镜检·优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；·缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。间接免疫荧光法的注意事项·荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h。

    这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议pH在。（中性及弱碱性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）9）拍照有条件的话比较好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以**多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。***中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。

    ）问题及其解答：如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色？1、非特异性染色产生原因及其解决方案：⑴游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。⑵抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。⑶组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。⑷从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。⑸抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。⑹荧光素不纯、标本固定不当等。⑺一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至比较好。⑻一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。2、阴性染色产生的原因有：⑴一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥。⑵荧光素提前衰退。

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