具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。***，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。6）复染目的是形成细胞轮廓，天津四色免疫组化实验服务，从而更好对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。7）封片为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。8）切片清洗为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：⑴单独冲洗，防止交叉反应造成污染。⑵温柔冲洗，天津四色免疫组化实验服务，防止切片的脱落，天津四色免疫组化实验服务。我喜欢用浸洗方式；⑶冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。⑷PBS的PH和离子强度的使用和要求。天津四色免疫组化实验服务

    定位准确、简便、快速、鲜明，在许多领域中仍占有不可取代的地位。如肾活检、皮肤活检中IgG、IgM、IgA、C3等检测，自身抗体的检测，传染病的快速诊断，单克隆抗体的筛选及鉴定等。随着科学技术地不断发展，免疫荧光组织化学技术已经广泛应用于生命科学的各个领域，放射出更加五彩缤纷的荧光。参考文献（1）AkivoshiKawamura,.（2）王伯沄.免疫荧光组织化学和荧光组织化学技术.第四军医大学科技资料增刊,1974;2:5-30.（3）.（4）WickG,TraillKN,.（5）.（6）蔡文琴,王伯沄主编.实用免疫细胞化学.成都：四川科技出版社1990，P968-977.（7）李成文.现代免疫化学技术.上海:上海科技出版社1992；P97-100.（8）Mahmudi-A3er-s,Lacy-P,Bablit2-B,(1-2):113-119.（9）Magro-C-M,(9):543-552.（10）(4):286-298.（11）GregoniWeber,(1):419-422.（12）SavigeJA,PaspaliansB,SilvestriniR,(ANCA)(18):568-571.（13）BallouB,FisherGW,DengJS,(3):251-257.（14）GruberHJ,HahnCD,KadaG,(5):696-704.（15）SouthweelBR,(5):1140-1151.（16）ArsenievL,PickerdN,GoudevaL,(5):547-559.（17）O'BrjenTE,MetheneyCD,(TIGR)proteinintrabecularmeshworkandschlemm'(6):517.（18）HuangMC。江苏五色免疫组化实验服务

    免疫细胞化学技术抗原和抗体的要求·具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。–对抗体的要求：纯度高、比活性强；·高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。–对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。免疫细胞化学技术抗原(antigen,Ag)·抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：–免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；–免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。·根据抗原是否显示免疫原性分为：–完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。·免疫原性**强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。–半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和***等。·半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。载体·通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。–常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。

    我身边有个研究生同学在我们实验室初次涉入免疫组化，听说步骤不难，跟我后面做了几次之后，就自己开始做了，连续做了三次，结果均是阴性染色。很扫兴，不知是什么原因导致的，后来我还是请教了上海舜田生物老师，她**提供给我我很大的帮助，解决问题的思路也逐步清晰。问题及其解答：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎么这么高稀释度也没能做出阳性结果？另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索比较好浓度。2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是比较好的时间和次数。若不行，还可高压修复。3、组织切片本身这种抗原含量低；4、血清封闭时间过长。5、DAB孵育时间过短。6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。我的实际解决方案：1、首先，排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少。免疫组化中两个**重要的因素是抗原和抗体。

    在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。3）免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。5、被检测的物质组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、***、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。6、特点1）特异性强免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。2）敏感性高在应用免疫组化的起始阶段。天津四色免疫组化实验服务

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免疫组织化学是一项在医学基础与临床科研中被广泛应用的一项技术，免疫组化染色服务也是生物公司的一项常规服务之一。该技术融合了抗原和抗体特异性结合的免疫学技术与组织学技术，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，来对组织或细胞内抗原进行定位和定量研究。肽类、***、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等，它们的组织细胞内具有抗原性的物质，所以均可以用免疫组织化学方法显示。免疫组化常用的显色剂包括荧光素、酶、生物素和铁蛋白等。11、金属离子和金属蛋白复合物

金属离子和金属蛋白复合物如铁蛋白、金和汞可以作为免疫组化反应中的标记物。如铁蛋白等，主要应用于免疫电镜。免疫金银法的基本原理是用特异性抗体与抗原反应，随后用金标记的间接抗体或SPA蛋白，再与特异性抗体结合，用乳酸银处理，使银颗粒沉积在金颗粒上，还原银反应而显示出黑褐色。适用于石蜡切片、冰冻切片，培养细胞，细胞涂片和树脂包埋的电镜切片。这种方法敏感性高，可检测组织中微量抗原，定位准确、无扩散现象且背景清洗，对比度好、方法简便。 天津四色免疫组化实验服务

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