避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。几点说明·一抗(假设来自种属A)的稀释度可大些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。·二抗——桥抗体(抗种属A的IgG抗体)应过量，使其Fab段一个与一抗结合，另一个则游离。·因抗酶抗体与一抗均系种属AIgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起桥作用，将其连接在与组织抗原结合的一抗上。(2)非标记抗体酶法——PAP法·与酶桥法相似，不同的是，PAP法将酶桥法的第3、4步并为1步，用PAP复合物代替;·PAP是离体制备的复合物(HRP--抗HRP)。·显色与酶桥法相同，PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解，形成不溶性终产物。PAP法评价·PAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。–缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床常规检查。·由于常做石蜡切片，北京七色免疫组化检测服务，故可用于回顾性研究。免疫细胞化学技术亲和组织化学法·是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础，北京七色免疫组化检测服务，北京七色免疫组化检测服务。·这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。生物素—抗生物素染色法【原理】·生物素(biotin)又称维生素H。

    我一般初次做一种新抗体，喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次，然后决定是向高还是低方向摸索。一般先决定二抗的浓度（工作液就好办了，直接滴加），重点摸索一抗的**适浓度。注意：免疫反应中存在前带和后带效应，这提示不是浓度越高，阳性率就越高，反之亦然。⑷重要原因排除之后，也不要忽视抗体的质量：原装抗体一般比较稳定，效果较好；而进口分装次之；工作液可能要注意质量问题。3、同时，DAB的孵育时间可能要适当延长，在镜下观察，有时可延长至30min。但一般3-10min比较好，此时背景也较浅。否则，说明抗体浓度不合适。4、***，血清封闭时间也可相应缩短。一般10-30min，但这个时间可以调整，封闭主要是降低切片的总体背景着色。5、此外，细胞通透也不可忽视。许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透，因为切片时可能已经把细胞切开了，但对于胞**白，建议还是通透一下，促进抗体等试剂充分进入参与反应。6、以上原因，都是针对实际中常见原因来进行分析的，前提是排除操作者的操作错误而引起阴性结果，这就需要新手还是要设置阳性对照以排除方法的问题。还有抗体稀释液的pH值过低等其它原因的干扰。总之，要想把免疫组化做好，可能每一个环节都很重要。

    但也存在主次之分，出现问题了，需要通过先排除主要的，再依次排除次要的--这是衡量你对免疫组化原理掌握与否的关键所在。案例三石蜡切片免疫荧光染色呈阴性结果或非特异性结果背景：因实验需要，于2008年07月04日初次做肝脏组织ZO-1（一种胞膜蛋白，紧密连接蛋白）免疫荧光染色，以前我对酶免疫组化非常熟悉，在丁香园子内也有不少置顶贴和精华帖，但免疫荧光一直还没做过（原理知道，但细节不太了解）。我先用石蜡切片做了5次，结果一直不理想（表现为未见特异性强染色）；近几日，在舜田生物老师的帮助下，我又切了冰冻切片，做了2次，终于基本成功了。在这个过程中，我对免疫荧光染色技术有了全新的认识，而前些天发出免疫荧光求助贴，回复的很少，所以有必要加强对免疫荧光方面的讨论），不妥之处敬请指正。有人会问酶免疫组化做的好好的，为何要做免疫荧光？其实，这也是我以前思考的难题，现在我认为可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫组化可能做不出来，需要敏感的免疫荧光方法来进行蛋白检测（我是看许多外文文献都是这样做的，因此选择免疫荧光染色。

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