二、  建株方法

1、  取外周血3-4ml，肝素抗凝（血液室温可放置48小时），应用液浓度5u/ml，可加入5-10ml外周血。

2、  将血液与等量1640培养液混匀后，沿管壁渐渐加入到含有4ml淋巴细胞分离液的离心管中（混合血：淋巴细胞分离液=6：4），3000转离心10分钟。

3、  吸取白细胞层，移入另一支离心管中，加入不含血清的1640培养液6ml，轻轻混匀，进行***次洗涤。1500转离心15分钟。

4、  弃上清液，再加6ml1640全培养液进行第二次洗涤，离心1500转15分钟。

5、  弃上清液，加入2ml1640全培养基（全培养基加入前，江苏HPV法细胞永生化，置37度水浴10分钟），然后加入环胞霉素A（4%）和1.2mlEBV液/份，充分混匀后移入到25平方厘米的培养瓶，置37度，5%CO2培养箱中，江苏HPV法细胞永生化。

6、  每2-3天加入3ml新鲜配制的培养基（1.6% 1M HEPES 缓冲液；15%胎牛血清（FBS）；1%青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到**），江苏HPV法细胞永生化。7天左右镜下观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象。

    众所周知，原代细胞**真实地反映特定细胞在体内的生理状态。然而，它们一般传不了几代就会停止增殖并死亡。对于一些需要大量细胞进行的实验比如生化分析，遗传筛选等，无法使用原代细胞。这阻碍了原代细胞在实验室的应用。另外，一些稀有疾病获得的血液或者组织样本比较少，导致获得的细胞数目比较有限。限制了后续实验的正常进行。而对于可以无限传代的细胞系，虽然没有衰老的问题，但它们通常包含许多遗传突变，表现出不稳定的核型，蛋白质表达模式也与细胞类型不相称。问题来了，是否有一种办法可以使原代细胞获得永生化的同时维持正常细胞的生理特性呢？引起细胞永生化的因素很多，其中端粒酶在这一过程中发挥重要作用。端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构。由端粒DNA和端粒蛋白质组成。正常动物细胞DNA的端粒随着细胞分裂而缩短，当缩短到一定长度时细胞将停止增殖并死亡。将原代细胞转染端粒酶逆转录酶cDNA（humantelomerasereversetranscriptase,hTERT），可以***端粒酶活性，维持端粒长度，阻止染色体端粒降解，诱导细胞永生化。有研究表明，hTERT介导的永生化细胞可保持正常细胞的生理特性。通过对多种hTERT永生化细胞系研究确认。

    端粒在*前期细胞中很短，因为端粒酶刚好足够维持而不延长端粒。“我们的发现调和了有关携带这些突变的**的相互矛盾的信息，”霍克迈耶说。该发现还解决了另一个**近的直觉性发现：端粒较短的人更能抵抗黑色素瘤。他说，原因是如果一个TERT启动子突变会引起*前病变-痣或痣-向黑色素瘤，那么在端粒短的人中，在细胞死亡之前死亡的机会会更大，才能调节端粒酶和使细胞永生化。该研究还涉及从人多能干细胞分化的细胞工程化TERT启动子突变。结果与在UCSF的HelenDiller家族综合**中心的患者中获得的人类皮肤损伤中观察到的进展相同，并在Bastian指导的临床**基因组学实验室中进行研究检查。原标题：.,"MutationsinthepromoterofthetelomerasegeneTERTcontributetotumorigenesisbyatwo-stepmechanism,"Science(2017).1126/返回搜狐。

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