纯度检测

  RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

  变性琼脂糖凝胶电泳测定

  制胶

  1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

  灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，北京食品安全荧光定量PCR课题承包，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米，北京食品安全荧光定量PCR课题承包，北京食品安全荧光定量PCR课题承包。

  准备RNA样品

  取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

  电泳

  上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。

  紫外透射光下观察并拍照

SYBR Green I法：SYBR Green I是一种具有绿色激发波长的染料，比较大吸收波长约为 497 nm，发射波长比较大约为 520 nm，可以和所有的 dsDNA 双螺旋小沟区域结合。因为在游离状态下 SYBR Green I 发出的荧光较弱，但是当它与双链 DNA 结合后，荧光就会**增强，而且荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。此法的优点是它可以监测任何 dsDNA 序列的扩增，检测方法较为简单，成本较低，但也正是由于荧光染料能和任何dsDNA 结合，如非特异性扩增产物和引物二聚体也能与染料结合而产生荧光信号，使实验产生假阳性结果，因此其特异性不如探针法。因为非特异性产物和引物二聚体的变性温度要比目标产物的低，所以可以在熔解曲线反应过程中利用软件分析仪器收集到信号进行鉴别

Rn 值是由 Applied Biosystems™ FAM™ 染料的荧光除以 ROX 染料的荧光而计算得出的比率。因此，假定 FAM 染料产生的荧光信号保持不变，ROX 染料量越少，产生的 Rn 值就越高。这将导致 Rn 基线上升，以及随后 ΔRn 的减少和 Ct 值的变化。通过降低 ROX 染料水平而得到不同 Ct 值，没有对反应的真实灵敏度产生任何影响，却有着意想不到的后果。如图 4 所示，降低 ROX 染料的浓度可能会增加 Ct 值的标准差。标准差越大，分辨靶浓度之间的细微区别的可信度就越低（参加下文的精确度一节）。

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