1)动物的选择选择什么动物来免疫取决于：·所需抗血清的量–小鼠只能提供～，而山羊能提供几升，上海多色荧光免疫组化染色服务。·能供免疫用的抗原量–小鼠50μg足够，而山羊需要几毫克。(1)动物的选择(续)·动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。–例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。–常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在，雄性)为**常用。(2)佐剂(adjuvant)·一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢，上海多色荧光免疫组化染色服务。佐剂可延长滞留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。·**常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为：–弗氏不完全佐剂(Freund'sincompleteadjuvant)–弗氏完全佐剂(Freund'scompleteadjuvant)弗氏不完全佐剂(Freund'sincompleteadjuvant,FIA)·是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1，上海多色荧光免疫组化染色服务、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。·使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。弗氏完全佐剂(Freund'scompleteadjuvant,FCA)·在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2～20mg/ml)，即成为FCA。上海多色荧光免疫组化染色服务

    在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。3）免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。5、被检测的物质组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、***、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。6、特点1）特异性强免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。2）敏感性高在应用免疫组化的起始阶段。北京五色免疫组化实验服务

    ·若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。直接免疫荧光法的注意事项(续)·一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；·经荧光染色的标本比较好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。(2)间接法又称为荧光抗-抗体法需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。–可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。间接免疫荧光法操作步骤·标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；·一抗染色：–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用)，37C作用30min或4C过夜。·PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；间接免疫荧光法操作步骤(续)·加荧光标记的二抗抗体，37C湿盒避光作用30min。·PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；·甘油缓冲液封片·镜检·优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；·缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。间接免疫荧光法的注意事项·荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h。

    续)·**过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血·血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；·加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。免疫细胞化学技术标本的制备·标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件·免疫组化对组织和细胞标本的要求–保持所检标本原有的结构、形态；–在原位很大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。·免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。–各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的比较好方法。免疫组化中常用的组织和细胞标本·组织标本–石蜡切片–冰冻切片·细胞标本–组织印片–细胞培养片(细胞爬片)–细胞涂片免疫细胞化学技术石蜡切片·石蜡切片是制作组织标本**常用、**基本的方法–比较大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；–石蜡块还能长期存档，供回顾研究。·石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善。

    ·目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。(2)碱性磷酸酶(AP)及底物·AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：–偶氮偶联反应，底物为-萘酚磷酸盐，经水解后得-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fastblue)或坚牢红(fastred)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。–靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodylphosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。2、常用的免疫酶染色方法·又分为以下两种方法：–酶标抗体法·直接法·间接法–非标记抗体酶法·酶桥法·PAP法(1)酶标抗体法·通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。–优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。–缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。(1)酶标抗体法——直接法·将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，***用底物显色剂显色。(1)酶标抗体法——间接法·将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合。上海多标记免疫组化技术服务

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    –缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。(3)微波照射法·将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。·此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。(4)高压加热法暴露抗原·将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压2～3min，可取得极好的效果。·由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。(1)酸水解法·酸水解可使交联断裂、暴露抗原。·将玻片浸入1mol/LHCl溶液中，室温作用20min(温度升高，作用时间缩短)。·此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。加热法的注意事项·达到规定的温度(92～95C以上)；·维持一定的时间；·避免切片干涸(抗原可能完全丢失)；·加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；·修复液：–**常用的是；–***研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液()。4、载玻片的处理·抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防预防脱发片，常用粘附剂处理载玻片。上海多色荧光免疫组化染色服务

上海朝瑞生物科技有限公司一直专注于1.发布科研技术 2.发布应用技术 3.发布专业专长 4.发布科研成果 5.发布我的需求 6.发布筛选检验检测服务 7.发布协同代研发服务 8.发布升级改造产品服务 9.发布实验室及仪器设备共享 10.发布培训基地共享 11.发布工厂代加工及共享车间 12.发布科研/项目团队招聘13.发布研究生婚恋 14.发布项目整包服务 15.发布资源交换业务，是一家化工的企业，拥有自己**的技术体系。公司目前拥有高技术人才5~10人人，以不断增强企业核心竞争力，加快企业技术创新，实现稳健生产经营。公司业务范围主要包括：[ "科研技术服务", "应用技术服务", "科研成果转化", "科学产品销售" ]等。公司奉行顾客至上、质量为首、的经营宗旨，深受客户好评。目前公司已经成为[ "科研技术服务", "应用技术服务", "科研成果转化", "科学产品销售" ]的**企业，正积蓄着更大的能量，向更广阔的空间、更***的领域拓展。

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