细胞永生化端粒酶法

端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖**白酶，由RNA和蛋白质组成。端粒酶能以自身的RNA为模板，从端粒DNA3’-OH 末端延伸端粒或合成新的端粒DNA，天津鱼类细胞永生化， 以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短，从而维持端粒的长度，使细胞不会因端粒耗尽而出现凋亡，天津鱼类细胞永生化。正常情况下，天津鱼类细胞永生化，大多数体细胞端粒酶的表达是严格调控的，表达是瞬时和低水平的。在原代培养的细胞中稳定表达人端粒酶催化亚基(hTERT)基因能稳定端粒的长度，使细胞易于永生化，因此hTERT的activate是细胞永生化的重要步骤。虽然activate端粒酶活性能够使多种人和动物的细胞永生化，但是对于有些细胞，重建端粒酶活性并不足以使细胞永生化，还需要借助*基因法。 天津鱼类细胞永生化

B细胞永生化是一个历久弥新的研究课题,如何维持B细胞体外连续传代增殖并表达抗体的特性,对于研制***和诊断用抗体类***和制品具有重要的意义。B细胞永生化的方法包括杂交瘤技术,EB***或SV40***永生化以及遗传修饰法。永生化B细胞能快速有效的产生单克隆抗体,这种抗体能克服异源抗体产生的免疫排斥,是制备单克隆抗体的理想来源,成为研制***性单抗的重要方法。本文主要概述了B细胞永生化方法的研究进展与未来的发展方向,以供从事这方面研究的人员参考。上海细胞永生化实验承包

    如果细胞未能增加端粒酶表达，那么它们也不能永生化，并且**终因端粒变短而死亡，这是因为染色体连接在一起，在细胞分裂时会破碎。具有这种TERT启动子突变的细胞更可能上调端粒酶，这就使得它们尽管具有非常短的端粒，但仍能继续生长。不过，Hockemeyer说，端粒酶水平是较低的，结果就是一些未受保护的染色体末端在存活的突变细胞中出现，这可能导致突变和进一步促进**形成。Hockemeyer说，“在我们的论文发表之前，人们可能认为在TERT启动子中*获得这一个突变就足以使细胞永生化，以及当这种情形在任何时候发生时，端粒缩短就被消除。我们证实这种TERT启动子突变不能立即足以阻止端粒缩短。”然而，仍然不清楚**终是什么导致端粒酶上调表达，从而使得细胞发生永生化。Hockemeyer说，它不可能是另一个突变，而是影响端粒酶基因表达的表观遗传变化，或转录因子或其他的结合到端粒酶基因上游启动子上的调节蛋白表达的变化。“然而，我们有证据证实，第二步必须发生，而且是在端粒的长度缩短至一个临界值时发生的，在这时，端粒是功能故障的，并且导致基因组不稳定。”回想起来，这并不令人吃惊虽然大多数**似乎需要端粒酶变得永生化。

细胞永生化的关键是一种被称作端粒酶的酶，它让染色体在经常分裂的细胞中保持健康。这种酶延长染色体末端的端粒，在每次细胞分裂期间，这些端粒就会变短。

当端粒太短时，染色体末端彼此间连接在一起，当细胞分裂时，这会造成破坏，在大多数情况下会杀死细胞。

鉴于端粒随着细胞年龄的增加而变短，科学家们从理论上认为，从不会衰老的*细胞通过产生细胞在正常情形下不会产生的端粒酶而变得永生化，从而是得这些细胞长久性地保持较长的端粒。经估计，90%的恶性**利用端粒酶实现永生化，而且提出的多种**疗法都着重关注降低端粒酶在**中的产生。

在这项新的研究中，这些研究人员以体外培养的基因组工程细胞为实验对象研究了永生化过程，而且当皮肤细胞从痣进展为恶性黑色素瘤时，也追踪了它们，结果提示着端粒酶在**中起着更为复杂的作用。

论文通信作者、加州大学伯克利分校分子与细胞生物学助理教授Dirk Hockemeyer说：“我们的研究结果对如何考虑促进**产生的**早过程和将端粒酶作为***靶点产生影响。这也意味着端粒生物学在**产生的早期阶段发挥的作用已被极大地忽视。我们在黑

    但不能让它们一直具有较长的长度和保持健康。如果细胞未能增加端粒酶表达，那么它们也不能永生化，并且**终因端粒变短而死亡，这是因为染色体连接在一起，在细胞分裂时会破碎。具有这种TERT启动子突变的细胞更可能上调端粒酶，这就使得它们尽管具有非常短的端粒，但仍能继续生长。不过，Hockemeyer说，端粒酶水平是较低的，结果就是一些未受保护的染色体末端在存活的突变细胞中出现，这可能导致突变和进一步促进**形成。Hockemeyer说，“在我们的论文发表之前，人们可能认为在TERT启动子中*获得这一个突变就足以使细胞永生化，以及当这种情形在任何时候发生时，端粒缩短就被消除。我们证实这种TERT启动子突变不能立即足以阻止端粒缩短。”然而，仍然不清楚**终是什么导致端粒酶上调表达，从而使得细胞发生永生化。Hockemeyer说，它不可能是另一个突变，而是影响端粒酶基因表达的表观遗传变化，或转录因子或其他的结合到端粒酶基因上游启动子上的调节蛋白表达的变化。“然而，我们有证据证实，第二步必须发生，而且是在端粒的长度缩短至一个临界值时发生的，在这时，端粒是功能故障的，并且导致基因组不稳定。”回想起来。江苏细胞永生化哪家专业

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二、  建株方法

1、  取外周血3-4ml，肝素抗凝（血液室温可放置48小时），应用液浓度5u/ml，可加入5-10ml外周血。

2、  将血液与等量1640培养液混匀后，沿管壁渐渐加入到含有4ml淋巴细胞分离液的离心管中（混合血：淋巴细胞分离液=6：4），3000转离心10分钟。

3、  吸取白细胞层，移入另一支离心管中，加入不含血清的1640培养液6ml，轻轻混匀，进行***次洗涤。1500转离心15分钟。

4、  弃上清液，再加6ml1640全培养液进行第二次洗涤，离心1500转15分钟。

5、  弃上清液，加入2ml1640全培养基（全培养基加入前，置37度水浴10分钟），然后加入环胞霉素A（4%）和1.2mlEBV液/份，充分混匀后移入到25平方厘米的培养瓶，置37度，5%CO2培养箱中。

6、  每2-3天加入3ml新鲜配制的培养基（1.6% 1M HEPES 缓冲液；15%胎牛血清（FBS）；1%青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到**）。7天左右镜下观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象。 天津鱼类细胞永生化

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