如何建立稳定永生化细胞株？来源：北京安必奇生物科技有限公司2019-3-1访问量：512**论(0)研究背景正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这种现象称之为海弗利克极限。有的细胞自发或受外界因素的影响，可以从增殖衰老危机中逃离，从而拥有无限增殖的能力，该过程称之为细胞永生化。然而自发永生化的几率非常小，啮齿类动物为10-5-10-6，而人类细胞则更为罕见，小于10-12。通过转染技术将外源性永生化基因导入目的细胞或诱导衰老相关基因突变，上海动物细胞永生化，可以增加永生化的发生率，从而建立稳定的永生化细胞株。研究意义永生化细胞能够提供稳定均一、性状一致的细胞来源，并且可以降低材料成本，因此，它是体外研究细胞增殖，上海动物细胞永生化、分化、凋亡、衰老等的理想模型，加之，永生化细胞和肿瘤细胞关系密切，所以永生化细胞也是研究**发生机制的重要模型。另外，由于永生化细胞具有可以多次传代的特性，可以利用各种细胞永生化的方法使那些传代困难、增殖缓慢，上海动物细胞永生化、容易衰老的细胞获得永生，从而为研究人员提供更多的细胞资源。研究方法目前，人们已建立了多种细胞永生化的方法，包括：01***基因转染很多******能够诱导细胞永生化。上海动物细胞永生化

    Hockemeyer说，这种TERT启动子突变不能产生足够的端端粒酶来使得前*细胞永生化，但会延缓正常的细胞衰老，从而允许有更多的时间来让更多的jihuo端粒酶的变化发生。他猜测端粒酶水平足以延长**短的端粒，但不能让它们一直具有较长的长度和保持健康。如果细胞未能增加端粒酶表达，那么它们也不能永生化，并且**终因端粒变短而死亡，这是因为染色体连接在一起，在细胞分裂时会破碎。具有这种TERT启动子突变的细胞更可能上调端粒酶，这就使得它们尽管具有非常短的端粒，但仍能继续生长。不过，Hockemeyer说，端粒酶水平是较低的，结果就是一些未受保护的染色体末端在存活的突变细胞中出现，这可能导致突变和进一步促进**形成。Hockemeyer说，“在我们的论文发表之前，人们可能认为在TERT启动子中*获得这一个突变就足以使细胞永生化，以及当这种情形在任何时候发生时，端粒缩短就被消除。我们证实这种TERT启动子突变不能立即足以阻止端粒缩短。”然而，仍然不清楚**终是什么导致端粒酶上调表达，从而使得细胞发生永生化。Hockemeyer说，它不可能是另一个突变，而是影响端粒酶基因表达的表观遗传变化，或转录因子或其他的结合到端粒酶基因上游启动子上的调节蛋白表达的变化。 上海动物细胞永生化

    结果提示着端粒酶在**中起着更为复杂的作用。论文通信作者、加州大学伯克利分校分子与细胞生物学助理教授DirkHockemeyer说：“我们的研究结果对如何考虑促进**产生的**早过程和将端粒酶作为***靶点产生影响。这也意味着端粒生物学在**产生的早期阶段发挥的作用已被极大地忽视。我们在黑色素瘤中的发现很可能也适合其他的**类型，这也就意味着人们会更加仔细地研究较早的端粒缩短作为一种*****机制所发挥的作用。”从痣到**Hockemeyer、他在加州大学伯克利分校的同事们与加州大学旧金山分校皮肤病理学家BorisBastian及其同事合作，发现细胞永生化是一个两步骤过程，**初由***端粒酶的突变引起，但这种***水平较低。该突变位于端粒酶基因上游的一个启动子（被称作TERT），该启动子调节着端粒酶的表达水平。四年前，已有人报道过，大约70％的恶性黑色素瘤在TERT启动子中具有这种相同的突变。Hockemeyer说，这种TERT启动子突变不能产生足够的端端粒酶来使得前*细胞永生化，但会延缓正常的细胞衰老，从而允许有更多的时间来让更多的***端粒酶的变化发生。他猜测端粒酶水平足以延长**短的端粒，但不能让它们一直具有较长的长度和保持健康。

二、  建株方法

1、  取外周血3-4ml，肝素抗凝（血液室温可放置48小时），应用液浓度5u/ml，可加入5-10ml外周血。

2、  将血液与等量1640培养液混匀后，沿管壁渐渐加入到含有4ml淋巴细胞分离液的离心管中（混合血：淋巴细胞分离液=6：4），3000转离心10分钟。

3、  吸取白细胞层，移入另一支离心管中，加入不含血清的1640培养液6ml，轻轻混匀，进行***次洗涤。1500转离心15分钟。

4、  弃上清液，再加6ml1640全培养液进行第二次洗涤，离心1500转15分钟。

5、  弃上清液，加入2ml1640全培养基（全培养基加入前，置37度水浴10分钟），然后加入环胞霉素A（4%）和1.2mlEBV液/份，充分混匀后移入到25平方厘米的培养瓶，置37度，5%CO2培养箱中。

6、  每2-3天加入3ml新鲜配制的培养基（1.6% 1M HEPES 缓冲液；15%胎牛血清（FBS）；1%青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到**）。7天左右镜下观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象。

    这使得尽管端粒末端短，但它们仍能继续生长。然而，Hockemeyer说，端粒酶水平是边缘的，导致存活的突变细胞中的一些未受保护的染色体末端，这可能导致突变和进一步**形成。“在我们的论文之前，人们可以认为，在TERT启动子中*获得这一个突变就足以使细胞永生化，任何时候发生这种情况的时候，端粒缩短被取出，”霍克迈耶说。“我们显示TERT启动子突变不能立即足以阻止端粒缩短。”然而，仍然不清楚什么导致端粒酶的**终上调使细胞永生化。Hockemeyer说，它不可能是另一个突变，而是影响端粒酶基因表达的表观遗传变化，或转录因子或其他结合端粒酶基因上游启动子的调节蛋白表达的变化。“然而，我们有证据表明，第二步必须发生，第二步是由端粒起源于正在发生的端粒短缺，并且端粒可能功能失调并促使基因组不稳定。”虽然大多数**似乎需要端粒酶变得不死，但只有约10％至20％的**已知在端粒酶基因上游的启动子中具有单核苷酸变化。然而，这些包括大约70％的黑素瘤和50％的所有肝和膀胱*。Hockemeyer说，支持TERT启动子突变上调端粒酶的理论的证据一直是矛盾的：*细胞倾向于具有短端粒的染色体，但具有更高水平的端粒酶，其应该产生更长的端粒。根据新的理论。上海动物细胞永生化

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