3、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。比较大激发光波长为550nm；比较大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。4、花青类染料常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。5，上海四色免疫组化染色服务、乙酸甲酯其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯，上海四色免疫组化染色服务。其激发光谱有pH依赖性，是使用**多的细胞内pH荧光指示剂，上海四色免疫组化染色服务。比较大激发光波长为505nm，比较大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。 上海四色免疫组化染色服务

    9、碱性磷酸酶碱性磷酸酶（AKP），又称碱性磷酸单酯酶，是酶组织化学中**常用的酶之一。分布***，常见于活跃运输的膜上。该酶在碱性环境下能催化各种醇和酚的磷酸酯水解，**适pH为，可被Mg2+、Mn2+和某些氨基酸所***；**物、碘液、砷酸盐等可***其活性。显示AKP的方法很多，主要有钙钴法和同时偶联法。前者所需试剂便宜，容易购买，操作简单，但会出现假阳性。后者方法较灵敏，而且在正常组织内不存在萘酚，因此不会出现假阳性，但所需试剂较难购买。10、生物素（biotin）生物素是B族维生素之一。生物素在羧化、脱羧和转羧化反应中起辅酶作用。生物素是含硫水溶性维生素。广布于动物及植物组织，已从肝提取物和蛋黄中分离，是多种羧化酶辅基的成分。生物素标记反应简单、温和且很少***抗体活性，生物素标记的抗体可存放多年而不失活。能与生物素结合的二级试剂素，所需的各种标记物均可购置。此外，亲和素和链霉亲和素的结合背景水平非常低，结合紧密且快速，抗体很容易与经过化学修饰的活化生物素结合。生物素又可以与结合有酶、荧光染料的亲和素或链霉亲和素连接，后者已有商品试剂供应。这样只需将纯化抗体与生物素结合，就可用各种不同的标记物来检测。 北京多标记免疫组化技术服务

为了在同一张组织切片或细胞学涂片上同时或先后显示两种或两种以上的抗原，发展了双重和多重免疫组化技术。这对于在原位了解不同抗原的关系，将形态与功能相结合极为有用。

  近年来，双重标记技术结合了免疫组化和核酸分子杂交技术，已跨越蛋白质水平，进入DNA、RNA水平，可在同一细胞内显示两种不同的DNA或mRNA，或者显示DNA和蛋白质。也有人以放射性同位素标记和酶组织化学结合来显示靶DNA和抗原。双重染色的基本方法有双重荧光和双重酶标记法。双重荧光标记**常用的是FITC和TMRITC或RB200，双重酶标记常用的是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

    是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。·抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。·两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。–该系统一端偶联大分子生物反应体系，另一端连结标记物，后者加入酶的底物，产生颜色反应。(1)标记抗生物素—生物素法(labelledavidin-biotinmethod,LAB)：分为直接法和间接法。·直接法用生物素标记***抗体，与抗原结合；酶标记抗生物素，与生物素结合，然后进行酶呈色反应。·间接法用生物素标记二抗，酶标记抗生物素，先用***抗体与组织抗原结合，再将第二抗体与***抗体相连结，***进行呈色反应。(2)桥抗生物素一生物素法(bridgeavidin-biotinmethod，BRAB)–此法是用生物素分别标记抗体和酶，以抗生物素为桥，把二者连接起来，进行呈色反应。(3)抗生物素-生物素-过氧化物酶法(ABC法)·ABC法是在BRAB和LAB的基础上改良的方法。·ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上。

    –缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。(3)微波照射法·将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。·此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。(4)高压加热法暴露抗原·将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压2～3min，可取得极好的效果。·由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。(1)酸水解法·酸水解可使交联断裂、暴露抗原。·将玻片浸入1mol/LHCl溶液中，室温作用20min(温度升高，作用时间缩短)。·此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。加热法的注意事项·达到规定的温度(92～95C以上)；·维持一定的时间；·避免切片干涸(抗原可能完全丢失)；·加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；·修复液：–**常用的是；–***研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液()。4、载玻片的处理·抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防预防脱发片，常用粘附剂处理载玻片。上海四色免疫组化染色服务

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    6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3分钟×5次。7）应用DAB溶液显色。8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。三、免疫荧光技术（略）1、酶免疫组化的关键环节1）标本固定固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用Bouin’s液或mDF液效果较好。2）脱水、石蜡包埋和制片脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。3）脱蜡和水化这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60℃20min，然后立即二甲苯1-3分别10min（这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定的），但当天制好的切片一般先60℃3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。4）抗原修复由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露。上海四色免疫组化染色服务

上海朝瑞生物科技有限公司创建于2003-01-22，注册资金 700-1000万元，是一家专注1.发布科研技术 2.发布应用技术 3.发布专业专长 4.发布科研成果 5.发布我的需求 6.发布筛选检验检测服务 7.发布协同代研发服务 8.发布升级改造产品服务 9.发布实验室及仪器设备共享 10.发布培训基地共享 11.发布工厂代加工及共享车间 12.发布科研/项目团队招聘13.发布研究生婚恋 14.发布项目整包服务 15.发布资源交换业务的公司。目前我公司在职员工达到5~10人人，是一个有活力有能力有创新精神的高效团队。公司业务范围主要包括：[ "科研技术服务", "应用技术服务", "科研成果转化", "科学产品销售" ]等。公司奉行顾客至上、质量为首、的经营宗旨，深受客户好评。目前公司已经成为[ "科研技术服务", "应用技术服务", "科研成果转化", "科学产品销售" ]的**企业，正积蓄着更大的能量，向更广阔的空间、更***的领域拓展。

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