在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。（注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有5－10%正常羊血清，这一步可以省略。）6.缓冲液洗5min/2次。7.滴加一抗工作液37℃孵育1－2小时。（具体孵育时间和温度由试验者**终决定）8.缓冲液洗5min/2次。9．滴加PrimaryAntibodyEnhancer（增强子），在室温下孵育20分钟。10．缓冲液洗5min/2次。11．滴加HRPPolymer（酶标二抗），在室温下孵育30分钟。（注：HRPPolymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）12．缓冲液洗5min/2次。13．向1mlDABPlusSubstrate（或AECPlusSubstrate)中滴加1-2滴DABPlusChromogen（或AECPlusChromogen），混匀后滴加到切片上，孵育3－15分钟。（具体时间由染色深浅决定。）14．自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。免疫组化操作步骤⑴、石蜡切片脱蜡至水。⑵、3%H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。⑶、蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟x2（如需抗原修复，可在此步后进行）。⑷、5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟，北京多标记免疫组化技术服务，北京多标记免疫组化技术服务，北京多标记免疫组化技术服务，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。⑸、PBS冲洗，5分钟x3次。北京多标记免疫组化技术服务

多光谱成像技术多光谱成像技术，可俗称免疫荧光多标，即将我们常见的免疫荧光双标提高到六标，实现了在同一张组织切片上同时标记3~6种蛋白，解决了科研中经常遇到的标记蛋白种类太少，无法在同一张切片上观察不同细胞或者多种蛋白分布情况的难题。那么多光谱成像技术是什么工作原理，同时又具有哪些更加强大的功能？

多光谱成像技术由多标染色、图像采集和图像分析三大模块组成。多标染色采用的是Opal/TSA多标记免疫荧光技术，打破了常规免疫荧光技术的局限性，不受一抗的种属来源限制，能够在同一组织切片样本上复染多达7种荧光标记（含DAPI在内）。图像采集采用了Vectra全光谱图像采集技术，这是***一代的组织切片成像分析系统，创新性的将光谱成像和切片全景扫描功能完美融合，实现了**性的技术跨越，通过光谱拆分能够去除自发荧光的干扰，有效识别多重荧光信号，从而获得***图像，确保能够进行精细的定量定位分析。

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    ·免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1混合乳化后(油包水)注入动物。–一般***注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。佐剂与抗原乳化的方法·研磨法：适于制备大量的佐剂抗原–先将不完全佐剂加热，取；缓缓滴入，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。–按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。·缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。佐剂与抗原乳化的方法(续)·注射器混合法–将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。·优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。·缺点：不易乳化，时间长。佐剂与抗原乳化的方法(续)·快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。–将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下，离瓶底，以免打碎离心管。–每次乳化10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。·优点：简单、快速、节省材料。

    –新载玻片上有油污，要用洗液浸泡12～24h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。·常用的粘附剂有：–APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）–Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸）–铬明胶溶液APES(3-aminopropyltriethoxysilane)3-氨丙基三乙氧基硅烷·现用现配。用纯**或甲醇配制2%APES(v/v);·将洗净的玻片浸于此液中20～30秒钟；·取出稍停片刻，再入纯**酮溶液洗去未结合的APES，置通风橱中晾干或60C烤箱烤干。Polv-L-Lysine(多聚赖氨酸)·将清洁玻片浸于100g/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释)，37C放置30min，然后60C烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。铬明胶溶液·试剂：铬明矾(chromealum)明胶(gelatine)蒸馏水500ml·先将铬明矾溶解于40C少量蒸馏水中，再加入明胶及蒸馏水，可在70C水浴中使明胶溶化，搅拌均匀后，即可使用。如有残渣，可过滤后再用。·用时稍加溶化，切片浸入2～3min，过夜晾干。免疫细胞化学技术冰冻切片·冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。·在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。–缩短了制片时间–抗原性不受损失·对稳定性差的抗原。

    但也存在主次之分，出现问题了，需要通过先排除主要的，再依次排除次要的--这是衡量你对免疫组化原理掌握与否的关键所在。案例三石蜡切片免疫荧光染色呈阴性结果或非特异性结果背景：因实验需要，于2008年07月04日初次做肝脏组织ZO-1（一种胞膜蛋白，紧密连接蛋白）免疫荧光染色，以前我对酶免疫组化非常熟悉，在丁香园子内也有不少置顶贴和精华帖，但免疫荧光一直还没做过（原理知道，但细节不太了解）。我先用石蜡切片做了5次，结果一直不理想（表现为未见特异性强染色）；近几日，在舜田生物老师的帮助下，我又切了冰冻切片，做了2次，终于基本成功了。在这个过程中，我对免疫荧光染色技术有了全新的认识，而前些天发出免疫荧光求助贴，回复的很少，所以有必要加强对免疫荧光方面的讨论），不妥之处敬请指正。有人会问酶免疫组化做的好好的，为何要做免疫荧光？其实，这也是我以前思考的难题，现在我认为可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫组化可能做不出来，需要敏感的免疫荧光方法来进行蛋白检测（我是看许多外文文献都是这样做的，因此选择免疫荧光染色。北京多标记免疫组化技术服务

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    用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4℃避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。7）血清封闭组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min。但也要防止封闭过度8）一抗和二抗浓度和孵育时间一抗孵育条件在免疫组化反应中**重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果比较好；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37℃30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4℃比较好，反应温和，但时间比较好超过16~24h。北京多标记免疫组化技术服务

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