荧光定量PCR 技术，是通过在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时监测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，对起始模板进行定量分析的方法。实验采用两种定量方式，即***定量和相对定量。荧光定量PCR 可用于mRNA 表达量水平检测、MicroRNA 表达量水平检测和基因拷贝数检测。实验的方法可分为SYBR Green I 法和TaqMan 探针法。

客户提供提供样本

细胞：细胞数>10^6；

组织：总量>100 mg；

DNA 或RNA 样品：总量>2 μg。

可选样本引物：可由客户提供，没有引物的情况下，可由生工生物设计合成

提供信息

靶基因信息：包括基因序列或GenBank Accession Number 等；背景资料：包括生物物种信息（Human、Mouse，天津病原微生物荧光定量PCR分析服务、Rat 等）、DNA/RNA 来源，天津病原微生物荧光定量PCR分析服务，天津病原微生物荧光定量PCR分析服务、基因丰度等。**终交付交付报告

实验报告：包括实验方法、步骤、所用试剂、仪器、照片及相关分析数据等。

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RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

  溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用***反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定

  先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 天津病原微生物荧光定量PCR分析服务

实时荧光定量常用Taqman探针法和SYBR Green I法两类。

1.TaqMan探针法

TaqMan 探针法是具有高度特异性的定量PCR技术。它的工作原理为有一对 PCR 引物和一条探针存在于PCR 反应体系中，有荧光淬灭基团存在于3′

端标记，有报告基团存在于探针的5′ 端标记，探针*和模板特异结合，两条引物之间是其结合点。因此信号仪器搜集不到，伴随反应的进展，探针在外切核酸酶的活性的作用下被切断，从而造成淬灭基团不能吸收基团的荧光能量，从而使荧光信号产生，所以模板 DNA 的拷贝数取决于信号的强度。

2.SYBR Green I法

SYBR Green I为一种具有绿色激发波长的染料，其发射波长比较大约为 520 nm，比较大吸收波长约为 497 nm，能够结合所有的双螺旋小沟区域。由于处于游离状态，SYBR Green I发出的荧光较弱，然而其结合双链 DNA之后，就会使得荧光**增强，荧光信号的增加完全同步PCR 产物的增加。

实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）指的是在PCR进行的同时，对其过程进行监测的能力（即实时）。因此，数据可在PCR扩增过程中，而非PCR结束之后，进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了**性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中，反应以循环中***检测到目标扩增的时间点为特征，而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的***增加。相反，终点法检测（也称 “读板检测”）测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。

在实时荧光PCR中。模板的定量有2种方法：***定量和相对定量。***定量一般通过已知的标准曲线来确定我们所感兴趣基因的拷贝数；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化

相对定量：相对定量法又分为两种

比较标准曲线的相对定量法：在一定样本中，靶序列相对于另一参照样本量变化情况进行分析的方法为相对定量法。在采用该方法过程中，需要有参照物，所以较容易绘制定量标准曲线，只要将标准品稀释度确定便可进行对比分析 北京非编码RNA 荧光定量PCR技术服务

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实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）技术是在PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术，是1996年美国Applied

Biosystems公司推出，它是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，然后利用荧光信号的积累强弱实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知的DNA模板进行定量。 天津病原微生物荧光定量PCR分析服务

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