·若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。直接免疫荧光法的注意事项(续)·一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；·经荧光染色的标本比较好在当天观察，北京七色免疫组化，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。(2)间接法又称为荧光抗-抗体法需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，北京七色免疫组化，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。–可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体，北京七色免疫组化。间接免疫荧光法操作步骤·标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；·一抗染色：–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用)，37C作用30min或4C过夜。·PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；间接免疫荧光法操作步骤(续)·加荧光标记的二抗抗体，37C湿盒避光作用30min。·PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；·甘油缓冲液封片·镜检·优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；·缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。间接免疫荧光法的注意事项·荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h。北京七色免疫组化

    80年代到90年代相继又有新的荧光素出现如R-藻红朊、B-藻红朊、C-藻青蛋白、cy2、cy3、cy5和cy7等均在流式细胞仪和激光共聚焦显微镜中广泛应用。由于免疫荧光组织化学的特异性，快速性和在细胞水平定位的准确性，已在免疫学、微生物学、病理学、**学以及临床检验等许多方面得到广泛应用，日益发挥重要作用。[1]免疫组织化学技术现状与展望编辑免疫荧光组织化学技术经过半个多世纪的不断改进和创新，已成为现代研究生物和医学的重要手段之一。由于免疫荧光技术与形态、机能相结合不断完善和发展，尤其是合成了多种新荧光素与抗体容易结合，且结合物稳定。可以和FITC结合进行免疫荧光组织化学双标记或三标记。至今，它已和亲合化学技术如SPA、Biotin以及avidin、ConA相结合，应用领域也日益扩大，又与现代的电子计算机、扫描电镜技术、共聚焦显微镜、荧光***细胞分类器（FACS）以及数码相机摄影技术的应用，使得快速性、简便性有了更大的提高，使得定量更加准确。90年代又开展了荧光原位末端标记和荧光原位杂交技术，使得应用范围更广。虽然免疫组织化学技术有了很大的发展，如免疫金银法、免疫胶体金法、SP、Evision二步法和CSA法，但由于它有自己独特的优点：特异性强。天津六色免疫组化染色服务

    免疫细胞化学技术组织印片·将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷**或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。免疫细胞化学技术细胞培养片(细胞爬片)·贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(**-20C固定10～20min)，再进行免疫染色。–盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。–为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。免疫细胞化学技术细胞涂片·大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：–血液、尿液、脑脊液；–体腔积液；–组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织–悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。免疫细胞化学技术细胞涂片(续)·细胞涂片的方法：–手涂法·将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。·图片范围应小于1cm直径，以节约试剂。–涂片机涂片法·将细胞样品制成2×105～6/ml细胞悬液，吸取50～100l(1～2×104～5cells)加入涂片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。免疫细胞化学技术常用染色方法根据标记物的不同分为免疫荧光法、免疫酶标法、亲和组织化学法。

    使许多疑难**得到了明确诊断。在常规**病理诊断中，5%-10%的病例单靠。尤其是免疫组化在**诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化**的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面：⑴恶性**的诊断与鉴别诊断；⑵确定转移性恶性**的原发部位；⑶对某类**进行进一步的病理分型；⑷软组织**的***一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织**的诊断是不可缺少的；⑸发现微小转移灶，有助于临床***方案的确定，包括手术范围的确定。⑹为临床提供***方案的选择。免疫组化免疫组化镜检在镜检前可以通过相关资料查询抗体的表达部位：细胞间质、细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核以及在其中的多个部位表达（如：MPO抗体表达在细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核上）和表达组织（如：VWF抗体在血管壁上表达，呈现环形）。在显微镜下观察时，先在4倍镜下查找组织及其范围，然后查看整个组织确定阳性产物的表达部位，然后将阳性产物表达部位置于视野正**，换高倍镜观察。

    我单独做了一次实验来排除该因素。结果孵育2、5min时先出现背景，而特异性染色较浅，故这不符合常理，一般先出现特异性染色，然后随着时间的延长，会出现非特异性背景着色。3、***，血清封闭的问题？以前我一般孵育15-30min，所以我单独做了一次实验用血清封闭室温1h，其它条件同做出来的那一次，结果也一样背景着色很深。4、此外，我在改进的同时，也对PBS清洗不断地延长时间和增加次数，甚至完全参照试剂盒说明书来进行操作（我以前一般一抗4℃过夜且室温复温45min、二抗37℃30min、SP反应37℃30min），以及过氧化氢灭活加强等等均未起到效果。我冷静地分析了一下整个实验流程，与***次做出来相比，只有两个地方做了改动：因血清不够而更换了不同厂家试剂盒、因抗体稀释液用完而重新买了抗体稀释液。5、我用PBS替代一抗稀释液（我以前还回收抗体，自我觉得抗体稀释液中含防腐剂和蛋白稳定剂），其它步骤和组织切片完全与***次做出来的一致（包括血清也是老试剂盒内剩余的一点），奇迹出现了：结果很好。因为抗原抗体反应除温度、抗原/抗体浓度外，然后就是pH值，于是我测了新抗体稀释液、老抗体稀释液和PBS的pH值，结果是前者偏酸性（<6、0），而后两者均在7、5左右。北京七色免疫组化

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    在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸-氨基反应而标记在蛋白分子上。(4)碘化丙啶(PI)·是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。·PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择。·比较大吸收光谱是493nm，比较大发射光谱是630nm，呈红色荧光。2、荧光抗体的保存·一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。–一般认为0～4C可保存1～2年，-20C可保存3～4年。–要小量分装，防止反复冻融。–保存前需加防腐剂(浓度为1:5000～10000的硫柳汞或1:1000～5000叠氮化钠)。3、免疫荧光的染色方法·免疫荧光染色法常用的有–直接法–间接法原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应(用来检测未知抗原)。直接免疫荧光法的操作步骤·标本的处理：–细胞涂片、细胞爬片浸入冷**或4%的多聚甲醛固定10min，然后用PBST(含pH)漂洗5min×3/次；–石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用PBST漂洗5min×3/次；·2%BSA或10%BSA37C湿盒内封闭30min·抗体染色：–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37C孵育30min；直接免疫荧光法的操作步骤(续)·PBS。北京七色免疫组化

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