实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）技术是在PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术，是1996年美国Applied

Biosystems公司推出，它是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，北京荧光定量PCR实验技术服务，然后利用荧光信号的积累强弱实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知的DNA模板进行定量。 北京荧光定量PCR实验技术服务

实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高和精确性高的优点，此项技术已被应用于分子生物学、医学、食品检测和环境监测等多个领域 。在分子生物学领域的研究应用  定量核酸浓度：传统方法是用琼脂糖凝胶电泳或者分光光度计测定核酸浓度，其结果不准确而且易污染，实时荧光定量PCR可以解决这些问题，它的准确性、灵敏度高且无污染，对一些传染性疾病进行定量分析、病原微生物和***含量检测，此项技术都是优先

研究基因表达：应用实时定量PCR技术可以对基因时间、空间表达水平差异进行比较。例如，对特定基因用物理、化学、***等不同方法处理后的差异进行比较，为人们的科学研究提供依据 天津水体基因组荧光定量PCR技术服务

所说的PCR应该就是**常规的PCR，以DNA为模板，通过上下游引物，实现DNA的扩增。

2、RT-PCR一般情况下是指反转录PCR（reverse transcription），尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也（realtime fluores-cence quantitative PCR）也简称RT-PCR，但是这是不对的，不推荐。

基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录，然后将所获得的cDNA作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法。

3、实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR，其比较大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。

至于三者的关系，RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR，在RNA实验中，这二者都会应用到

荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase ChainReaction，FQ-PCR；real-time quantitative PCR, RT-qPCR or qPCR)， 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记**PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度 [1]  。

荧光域值(threshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍

产生的 ΔRn 值也不同。请注意，荧光信号基线属于非模板依赖性因素，两种预混液的基线是不同的（图 3A）。Ct 值的变化并没有反映出反应系统的整体性能（图 3B）。灵敏度相当的预混液产生的 Ct ***值可能不同。

使用预混液 A 和预混液 B 在等量的人类 gDNA 中进行 RNase P 扩增。(A) Rn 根据循环数进行绘制，并且显示两个反应的基线。(B) 对数 (ΔRn) 根据循环数进行绘制。两种预混液的阈值（绿线）设定为相同水平。对于相同浓度的靶标而言，预混液 B 的 Ct 值 (CtB) 早于预混液 A 的相应值 (CtA)，表明预混液 B 的基线较低。使用 Applied Biosystems™ 7500 实时荧光定量 PCR 系统执行所有扩增。 北京siRNA荧光定量PCR技术服务

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实时荧光定量常用Taqman探针法和SYBR Green I法两类。

1.TaqMan探针法

TaqMan 探针法是具有高度特异性的定量PCR技术。它的工作原理为有一对 PCR 引物和一条探针存在于PCR 反应体系中，有荧光淬灭基团存在于3′

端标记，有报告基团存在于探针的5′ 端标记，探针*和模板特异结合，两条引物之间是其结合点。因此信号仪器搜集不到，伴随反应的进展，探针在外切核酸酶的活性的作用下被切断，从而造成淬灭基团不能吸收基团的荧光能量，从而使荧光信号产生，所以模板 DNA 的拷贝数取决于信号的强度。

2.SYBR Green I法

SYBR Green I为一种具有绿色激发波长的染料，其发射波长比较大约为 520 nm，比较大吸收波长约为 497 nm，能够结合所有的双螺旋小沟区域。由于处于游离状态，SYBR Green I发出的荧光较弱，然而其结合双链 DNA之后，就会使得荧光**增强，荧光信号的增加完全同步PCR 产物的增加。 北京荧光定量PCR实验技术服务

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