因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。·乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。(3)其它固定剂·**：–对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用**固定。3、抗原修复——原因·常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：–抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；–蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。·要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。3、抗原修复——方法·化学方法·加热方法–水浴加热法–微波照射法–高压加热法–酸水解法(1)化学方法·主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。–胰蛋白酶：一般使用浓度为～，消化时间为37C，10～40**要用于细胞内抗原的显示；–胃蛋白酶：一般使用浓度为～，消化时间为37C、30～180min，北京五色免疫组化技术服务，主要用于细胞间质抗原的显示。·例如：Laminin、CollagenIV(2)水浴加热法·将玻片放入装有抗原修复液的容器中，北京五色免疫组化技术服务，加热至沸腾，持续10～15分钟，北京五色免疫组化技术服务。–优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室。北京五色免疫组化技术服务

    免疫组化染色常用于的标记物。1、异硫氰酸荧光素（FITC）FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质较为常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色，其缺点是在光照下容易淬灭，易受自发荧光影响。比较大激发光波长为490nm；比较大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。免疫组化染色是医学和生命科学研究中经常要使用的研究方法。美迪西提供免疫组化染色服务，其生物部在体外生物学领域有丰富***的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。2、四乙基罗丹明（RB200）RB200能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和**，性质稳定，可长期保存，***应用于双标记示踪染色。比较大激发光波长为570nm，比较大发射光波长为595-600nm，荧光显微镜下发橙红色荧光。 上海五色免疫组化检测服务

    –将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。·优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。免疫双向扩散法的操作步骤·将玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。·将l%agar融化后，置56C水浴。·在玻璃板上铺胶，约厚，凝固后打孔(直径3rnm)，孔间距10mm。·中心孔加5l抗原样品，周围孔内每孔加5l抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。·凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。·观察结果。抗体效价检测的其它方法·环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；·对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；·酶联免疫吸附试验(ELISA)。(6)放血或定期抽血常用以下3种方法·颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：。家兔、山羊、绵羊等动物**常用此法。·心脏**法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。·静脉**：家兔可用耳缘静脉**；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉**，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。(6)放血或定期抽血。

    乳化剂的鉴定·判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。(3)免疫方法——免疫途径·常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。·一般采用多点注射方法–常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。–皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。(3)免疫方法——免疫途径(续)·几点说明：–大动物一般不用腹腔注射–颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射–抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100g抗原即可获得较好的免疫效果。–皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。(3)免疫方法——次数及间隔时间·次数一般为2～3次(初次免疫和加强免疫)–***注射后，10～15天再加强注射；–剂量同***或为***的一半，用不全佐剂或不用佐剂。·间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长–豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；–第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。举例1：家兔的免疫·初次免疫–用50～200gAg加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点～，也可肌肉内或皮内注射；·两周后，加强免疫–将50～200gAg于PBS或FIA中。

    我身边有个研究生同学在我们实验室初次涉入免疫组化，听说步骤不难，跟我后面做了几次之后，就自己开始做了，连续做了三次，结果均是阴性染色。很扫兴，不知是什么原因导致的，后来我还是请教了上海舜田生物老师，她**提供给我我很大的帮助，解决问题的思路也逐步清晰。问题及其解答：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎么这么高稀释度也没能做出阳性结果？另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索比较好浓度。2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是比较好的时间和次数。若不行，还可高压修复。3、组织切片本身这种抗原含量低；4、血清封闭时间过长。5、DAB孵育时间过短。6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。我的实际解决方案：1、首先，排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少。免疫组化中两个**重要的因素是抗原和抗体。天津多靶点免疫组化染色服务

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    这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，***通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。3、分类1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法。北京五色免疫组化技术服务

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