摘要：背景:胰腺*是恶性程度极高的消化道**之一,近年来发病率呈上升趋势,且具有发现晚、预后差、中位生存期短、5年生存率低等特点。目前,胰腺*的分子靶向***正在研究中,临床上仍以手术、放化疗为主要的***手段。**热疗,是一种通过加热技术使**病灶温度升高到一定程度,借以杀灭肿瘤细胞的一种***方法。近年来,随着热疗设备、技术等不断提高,热疗在临床中被普遍应用并取得一定效果。研究发现claudin蛋白(闭合蛋白)是细胞间紧密连接结构的重要组成部分。其家族成员***上调,包括80%的胃肠道腺瘤及60%的胰腺**等。其功能可能与细胞间黏附相关。目前II期临床试验结果显示,以***提高胃部**患者的无进展生存期和总生存期，江苏 重组人源Claudin18.2蛋白****，江苏 重组人源Claudin18.2蛋白****。这一临床试验结果为提高**患者***效果带来新的希望。因此***中的研究热点之一，江苏 重组人源Claudin18.2蛋白****。目的:本实验通过免疫细胞化学和WesternBlot法(蛋白质印迹法)观察人胰腺*PANC-1细胞、化疗对PANC-1细胞***的影响,以及热化疗对人胰腺*细胞的作用,为热疗、化疗在临床中的应用及抗体IMAB362在胰腺****中的开发提供更多的理论支持。方法:本实验采用人胰腺*细胞系PANC-1细胞进行以下研究:。江苏 重组人源Claudin18.2蛋白****

    MNaH2P04，MTris()充分平衡Ni柱，先用含10mmo1咪唑的6M尿素，，()洗脱杂蛋白，再用含250mmo1咪唑的6M尿素，，(pH8,0)洗脱目的蛋白。收集洗脱峰，纯化产物透析至2M尿素，，Tris(pH)复性，终浓度lmg/ml。***透析入Tris(pH)中，PEG8000浓縮后，用Bradford法测定蛋白浓度。动物模型实验小鼠分组与免疫方案分组将24只BALB/c小鼠分成4组，于小鼠背部皮下按照lx^个/只，每组6只分别接种胃*MFC和胰腺*MPC-83细胞各2组。每个肿瘤细胞接种2组荷瘤小鼠，待成瘤后，按照常规免疫方法分别注射盐水。在第4次免疫后10天摘眼球**，测定血清中抗。免疫方案背部皮下多点注射；rhClaudinl8,2:40ug/只+生理盐水总体积为200^L/只，分别隔周注射；第4次，使用:40Hg/只+生理盐水200liL/只，腹腔注射。ELISA法测定血清抗，收集抗血清，通过间接ELISA测定血清抗(:1311出。每个样品均设6个孔。ELISA实验方法如下所需溶液的配制a.包被缓冲液碳酸盐缓冲液取Na2C03:g(终浓度mol/L)，NaHC03:(终浓度mol/L)，纯水定容至200mL(),有效期两周。b.洗涤液含Tween-20的PBS()。c.封闭液含1%BSA的洗涤液。d.稀释液含BSA的洗涤液。e.底物缓冲液Na2HP04*12H20:g，柠檬酸mL(pH)。f.底物显色液OPD:8mg。江苏 重组人源Claudin18.2蛋白****

    在大肠杆菌中获得***表达，经亲和纯化后得到。(3)融合蛋白的纯化和复性表达产物经裂菌、溶解包涵体、Ni-NTA亲和层析柱的纯化，蛋白纯度可达80%以上。上述步骤(1)中rhHis-TT-Claudinl8,2蛋白的制备方法是采用RT-PCR方法从人胃*KATOIII细胞中获得，将该片段连接TT83,3基因片段后插入pQE-30载体中构建；含有目的基因；表达产物的鉴定；重组蛋白的纯化；***小鼠体内胃*MFC细胞和胰腺*MPC-83细胞的生长。本发明的重组人()，通过免疫荷瘤小鼠产生抗，从而有可能为胃*和胰腺*的免疫***提供一种新的蛋白质***。本发明的应用目的在于以体内产生针对，从而研究应用主动免疫的方法进行**的免疫***。依照本发明的技术方案，釆用RT-PCR的方法获得，构建原核表达载体，并在大肠杆菌中获得***表达。表达产物经溶解包涵体、Ni-NTA亲和层析柱的纯化，蛋白纯度可达80%以上。纯化后的性结合人胃*KATOIII和胰腺*PANC-1细胞以及小鼠胃*MFC和胰腺*MPC-83细胞的抗体，同时还可以***小鼠体内胃*MFC和胰腺*MPC-83细胞的生长。通过体外实验发现，使用的抗体可以特异性与胃*和胰腺*等多种肿瘤细胞结合；正常胃的细胞和组织与该**疫苗免疫后产生的抗体*有少量结合。

    其中claudin-4、claudin-7和ctaudin-18研究较多。Claudin-4定位在人类染色体7ql1。Lee等用免疫组化法研究发现E-cadherin和claudin-4在69n/。的胃*中均表达减少，且更常见于弥散型胃*和分化低的胃*，认为两种蛋白作用类似，可能与胃腺体结构的破坏和腺体细胞的分化丧失有关。Resnick等研究远端胃*患者通过COX多变量分析，发现**度claudin-4的表达与胃*患者生存期***下降有关。此外，Cunningham等。通过免疫组化方法发现claudin-4在36例肠化和14例不典型增生患者中均完全有表达，在98%胃*原位组织和**的转移*组织中也有表达，而*有15%的正常胃黏膜组织表达claudin-4，说明claudin-4在胃*早期的致*过程中也起了重要作用。Johnson等，在Trefoilfactor-l基因敲除的小鼠模型中通过基因序列分析发现，daudin-7基因是胃*中经常表达上调的基因，使用免疫组化方法发现，小鼠和人类胃黏膜腺体不典型增生时，常过度表达clandin-7，而其周围正常胃黏膜组织却不表达。其在肠化、不典型增生和胃*中表达阳性率分别为30%、80%和70%，并且多在肠型胃*中表达。Park等通过免疫组化和Westemblot方法发现，claudin-7更常表达于肠化、腺瘤和胃*中，而在47%的正常胃黏膜中不表达。

    还为我们通过组学研究(基因组、转录组和蛋白组等)系统地解析微生物基因转录表达和代谢网络提供了平台，将有助于特定基因靶标的甄选，为通过合成生物学技术实现更为***的微生物育种和精细人工调控创造条件。本文将对基因组重排在微生物菌种选育中的应用研究进行介绍，尤其针对近年来围绕其开展的组学研究进展进行详细阐述。1基因组重排技术在微生物菌种选育中的应用简介基于基因组重排的微生物菌种选育主要包括4大步骤[7](图1)：(1)构建具有基因和表型多样性的亲本文库。主要通过物理(辐射、紫外线等)、化学(化学诱变剂、生物制剂等)和核糖体工程等多元化手段来诱导随机基因突变并筛选获得性状或/和性能改良的正向突变菌文库[8]，以及其它具有特定表型的不同种属的微生物菌种等。一般具备特征筛选标记(如***抗性等)或/和表型(如耐酸、耐热)的亲本更利于后续的原生质体融合及筛选，并可在基因组重排过程中得到有效地累积；(2)原生质体的***制备。由于原生质体制备尚无普适性方法，主要采用酶解法去除细胞壁，因此酶的种类和用量、酶解时间、温度和pH等都会直接影响原生质体的质量[7]，需要对上述诸多条件进行优化才能获得高质量的原生质体；(3)原生质体的理性融合。江苏 重组人源Claudin18.2蛋白****

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