福尔马林)应用**广–原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。–优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。–缺点：·甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；·醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；·分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，天津四色免疫组化技术服务，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。–注意事项：·缩短固定时间，降低固定温度(4C)，为此组织块不宜过厚。·改用中性缓冲福尔马林，以pH值～，减少固定液pH的变化。·固定后充分水洗以减少分子间交联。·切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。·戊二醛：–穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。·多聚甲醛(常用4%)：–可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。·主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。(2)醇类·**常用的醇类固定剂是乙醇。–其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。–优点：穿透性强、抗原性保存好。–缺点：·脱水性强，天津四色免疫组化技术服务，天津四色免疫组化技术服务，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量。天津四色免疫组化技术服务

    续)·**过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血·血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；·加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。免疫细胞化学技术标本的制备·标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件·免疫组化对组织和细胞标本的要求–保持所检标本原有的结构、形态；–在原位很大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。·免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。–各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的比较好方法。免疫组化中常用的组织和细胞标本·组织标本–石蜡切片–冰冻切片·细胞标本–组织印片–细胞培养片(细胞爬片)–细胞涂片免疫细胞化学技术石蜡切片·石蜡切片是制作组织标本**常用、**基本的方法–比较大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；–石蜡块还能长期存档，供回顾研究。·石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善。天津五色免疫组化检测服务

    因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。·乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。(3)其它固定剂·**：–对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用**固定。3、抗原修复——原因·常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：–抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；–蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。·要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。3、抗原修复——方法·化学方法·加热方法–水浴加热法–微波照射法–高压加热法–酸水解法(1)化学方法·主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。–胰蛋白酶：一般使用浓度为～，消化时间为37C，10～40**要用于细胞内抗原的显示；–胃蛋白酶：一般使用浓度为～，消化时间为37C、30～180**要用于细胞间质抗原的显示。·例如：Laminin、CollagenIV(2)水浴加热法·将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。–优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室。

    由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3）定位准确、形态与功能相结合该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。7、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Westernblotting、ELISA的异同1）Westernblotting蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然Westernblotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或**白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。2）ELISA酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量**准确。

    免疫细胞化学技术免疫荧光法【原理】·用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；免疫荧光技术·荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；·借助于荧光显微镜进行观察。1、常用的荧光素·(1)异硫氰酸荧光素(FluoresceinIsothiocyanate,FITC)·(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TetramethylRhodamineIsothiocyanate,TRITC)·(3)四乙基罗丹明(RB200)·(4)碘化丙啶(propidiumiodide,PI)(1)异硫氰酸荧光素(FITC)·易溶于水和乙醇。·比较大吸收光谱为490～495nm，比较大发射光谱为520～530nm．呈翠绿色荧光，分子量。·在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上**多能标记15～20个FITC分子。(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)·比较大吸收光谱550nm，比较大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。·与蛋白质结合的方式同FITC。(3)四乙基罗丹明(RB200)·不溶于水，易溶于乙醇和**。·比较大吸收光谱为570nm，比较大发射光谱为595～600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。·RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)。天津五色免疫组化检测服务

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    但也存在主次之分，出现问题了，需要通过先排除主要的，再依次排除次要的--这是衡量你对免疫组化原理掌握与否的关键所在。案例三石蜡切片免疫荧光染色呈阴性结果或非特异性结果背景：因实验需要，于2008年07月04日初次做肝脏组织ZO-1（一种胞膜蛋白，紧密连接蛋白）免疫荧光染色，以前我对酶免疫组化非常熟悉，在丁香园子内也有不少置顶贴和精华帖，但免疫荧光一直还没做过（原理知道，但细节不太了解）。我先用石蜡切片做了5次，结果一直不理想（表现为未见特异性强染色）；近几日，在舜田生物老师的帮助下，我又切了冰冻切片，做了2次，终于基本成功了。在这个过程中，我对免疫荧光染色技术有了全新的认识，而前些天发出免疫荧光求助贴，回复的很少，所以有必要加强对免疫荧光方面的讨论），不妥之处敬请指正。有人会问酶免疫组化做的好好的，为何要做免疫荧光？其实，这也是我以前思考的难题，现在我认为可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫组化可能做不出来，需要敏感的免疫荧光方法来进行蛋白检测（我是看许多外文文献都是这样做的，因此选择免疫荧光染色。天津四色免疫组化技术服务

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