使用包含 3 种不同浓度的 ROX 染料的预混液对 TGF-β 进行扩增。显示 (A) Ct 值和 (B) 标准差随 ROX 染料浓度的变化。降低 ROX 染料浓度导致 Ct 出现得更早，但是会增大标准差。使用 Applied Biosystems 7500 实时荧光定量 PCR 系统执行所有扩增。
Ct 随 PCR 效率发生变化。蓝色标准曲线的效率为 **（斜率为 –3.3），天津siRNA荧光定量PCR实验技术服务。绿色标准曲线的效率为 78%（斜率为 –4），天津siRNA荧光定量PCR实验技术服务。与高效率条件相比（蓝色），天津siRNA荧光定量PCR实验技术服务，在低效率条件下（绿色），扩增量 Y 使 Ct 出现得更早。较低扩增量 (X) 时则情况相反，与高效率条件（蓝色）相比，低效率条件（绿色）使 Ct 出现得更晚。 天津siRNA荧光定量PCR实验技术服务
实时荧光定量常用Taqman探针法和SYBR Green I法两类。
1.TaqMan探针法
TaqMan 探针法是具有高度特异性的定量PCR技术。它的工作原理为有一对 PCR 引物和一条探针存在于PCR 反应体系中，有荧光淬灭基团存在于3′
端标记，有报告基团存在于探针的5′ 端标记，探针*和模板特异结合，两条引物之间是其结合点。因此信号仪器搜集不到，伴随反应的进展，探针在外切核酸酶的活性的作用下被切断，从而造成淬灭基团不能吸收基团的荧光能量，从而使荧光信号产生，所以模板 DNA 的拷贝数取决于信号的强度。
2.SYBR Green I法
SYBR Green I为一种具有绿色激发波长的染料，其发射波长比较大约为 520 nm，比较大吸收波长约为 497 nm，能够结合所有的双螺旋小沟区域。由于处于游离状态，SYBR Green I发出的荧光较弱，然而其结合双链 DNA之后，就会使得荧光**增强，荧光信号的增加完全同步PCR 产物的增加。 北京临床疾病荧光定量PCR课题承包
温度设置：在设置荧光 PCR 程序时，要仔细核对程序中的目标温度、恒温时间和循环次数等参数，参数设置不正确将直接影响 PCR 检测结果。延伸过程中要设置读取收集荧光信号，如不设置收集荧光，将无法保存试验数据，无法判定检测结果，造成试验失败 操作规范：在对样品进行核酸提取和实时荧光扩增时要规范操作，防止样品的交叉污染、 酶的降解、假阳性的出现 离心管、***头和 PCR 管均需要高压灭菌或使用商品化的无 污染的离心管、***头和PCR 管。核酸提取结束后应立即进行仪器扩增，提取的核酸不可长时间置于室温，易受空气中酶的降解，短期可保存于 －20 ℃冰箱，长期应保存于－70 ℃冰箱
产生的 ΔRn 值也不同。请注意，荧光信号基线属于非模板依赖性因素，两种预混液的基线是不同的（图 3A）。Ct 值的变化并没有反映出反应系统的整体性能（图 3B）。灵敏度相当的预混液产生的 Ct ***值可能不同。
使用预混液 A 和预混液 B 在等量的人类 gDNA 中进行 RNase P 扩增。(A) Rn 根据循环数进行绘制，并且显示两个反应的基线。(B) 对数 (ΔRn) 根据循环数进行绘制。两种预混液的阈值（绿线）设定为相同水平。对于相同浓度的靶标而言，预混液 B 的 Ct 值 (CtB) 早于预混液 A 的相应值 (CtA)，表明预混液 B 的基线较低。使用 Applied Biosystems™ 7500 实时荧光定量 PCR 系统执行所有扩增。
所说的PCR应该就是**常规的PCR，以DNA为模板，通过上下游引物，实现DNA的扩增。
2、RT-PCR一般情况下是指反转录PCR（reverse transcription），尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也（realtime fluores-cence quantitative PCR）也简称RT-PCR，但是这是不对的，不推荐。
基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录，然后将所获得的cDNA作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法。
3、实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR，其比较大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。
至于三者的关系，RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR，在RNA实验中，这二者都会应用到 北京**基因荧光定量PCR实验技术服务
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实时荧光定量PCR的应用
目前，qPCR技术已经广泛应用于生物医药食品等行业，应用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、***研究、**的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等，除此之外，还包括：
● 基因扩增
● 扩增特异性分析
● 基因定量分析
● 基因检测
● 基因分型
● SNP分析
● RFLP多态性分析
● 单/多基因表达研究
● 高通量基因表达谱研究
实时荧光定量PCR技术，顾名思义，就是在PCR的基础上加入荧光基团，通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应过程，***通过对未知模板进行定量分析的方法。 天津siRNA荧光定量PCR实验技术服务
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