混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。

  取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，天津siRNA荧光定量PCR分析服务，保存于-80℃待用。 管家基因(β-actin)实时定量PCR

  β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。

  反应体系如下：

  标准品反应体系 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 阳性模板上游引物F 0.5μl 3 阳性模板下游引物R 0，天津siRNA荧光定量PCR分析服务，天津siRNA荧光定量PCR分析服务.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 阳性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 天津siRNA荧光定量PCR分析服务

PCR 反应的效率也会影响 Ct 值。在低效率条件下进行连续稀释扩增，与高效率条件下相比，可能会产生斜率不同的标准曲线。在图 5 中，两个样品（X 和 Y）分别在低效率和高效率条件下扩增，在靶浓度相同的条件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中，尽管高效率条件（图 5 中的蓝色曲线）在高浓度时产生的 Ct 值更晚，但它在靶浓度低时却更为灵敏。PCR 效率取决于实验、预混液性能和样品质量。通常情况下，反应效率在 90-110% 之间都是可以接受的。另一方面，假定所有其他因素如仪器、试剂和实验完全相同， 该效率也有助于得出***个样品的模板量更少的结论。然而，如果产生两个 Ct值使用的是不同的仪器、试剂、引物和探针或反应体积，该结论就不成立。因此，只有在使用上文定义的相同反应条件来比较实验时，Ct ***值的比较才有意义。北京**基因荧光定量PCR实验技术服务

实时荧光定量PCR技术原理将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现，再根据标准曲线定量分析未知模板的方法，即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中，实时检测全程PCR扩增过程，按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。混合模板DNA和有荧光素的Taqman探针，遵守聚合酶链反应规律使高温变性，低温复性，适温延伸的热循环完成，切断和模板DNA互补配对的Taqman探针，荧光素在反应体系中游离。荧光在特定光激发下发出，被扩增的目的基因片段随着循环次数的增加呈级增长，Ct值根据实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度求取出来，同时对照多个已知模板浓度的标准品，就能够使待测标本目的基因的拷贝数得出。

温度设置：在设置荧光 PCR 程序时，要仔细核对程序中的目标温度、恒温时间和循环次数等参数，参数设置不正确将直接影响 PCR 检测结果。延伸过程中要设置读取收集荧光信号，如不设置收集荧光，将无法保存试验数据，无法判定检测结果，造成试验失败 操作规范：在对样品进行核酸提取和实时荧光扩增时要规范操作，防止样品的交叉污染、 酶的降解、假阳性的出现 离心管、***头和 PCR 管均需要高压灭菌或使用商品化的无 污染的离心管、***头和PCR 管。核酸提取结束后应立即进行仪器扩增，提取的核酸不可长时间置于室温，易受空气中酶的降解，短期可保存于 －20 ℃冰箱，长期应保存于－70 ℃冰箱 

荧光定量PCR实验步骤：

  取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

  两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

  RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 北京**基因荧光定量PCR实验技术服务

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SNP基因分型技术原理是PCR扩增含有SNP的基因组片段，主要特点是准确性高、灵活性强、通量大，主要方法是TaqMan探针法。TaqMan探针法 针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET，发出荧光。通常用于少量SNP位点分析。天津siRNA荧光定量PCR分析服务

上海朝瑞生物科技有限公司始建于2003-01-22，坐落于上海市松江区广富林路697号昂立大厦2113室，现有员工5~10人余人。zrbiorise,SPRICELL,scienceladde是上海朝瑞生物科技有限公司的主营品牌，是专业的1.发布科研技术 2.发布应用技术 3.发布专业专长 4.发布科研成果 5.发布我的需求 6.发布筛选检验检测服务 7.发布协同代研发服务 8.发布升级改造产品服务 9.发布实验室及仪器设备共享 10.发布培训基地共享 11.发布工厂代加工及共享车间 12.发布科研/项目团队招聘13.发布研究生婚恋 14.发布项目整包服务 15.发布资源交换业务公司，拥有自己**的技术体系。公司以用心服务为重点价值,希望通过我们的专业水平和不懈努力,将1.发布科研技术 2.发布应用技术 3.发布专业专长 4.发布科研成果 5.发布我的需求 6.发布筛选检验检测服务 7.发布协同代研发服务 8.发布升级改造产品服务 9.发布实验室及仪器设备共享 10.发布培训基地共享 11.发布工厂代加工及共享车间 12.发布科研/项目团队招聘13.发布研究生婚恋 14.发布项目整包服务 15.发布资源交换业务等业务进行到底。上海朝瑞科技始终以质量为发展，把顾客的满意作为公司发展的动力，致力于为顾客带来***的科研技术服务,应用技术服务,科研成果转化,科学产品销售。

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