实时荧光定量 PCR，又称为定量 PCR 或 qPCR，可以为测定样品中的靶标序列或基因数量提供简单、简洁的方法。该方法高度简化，有时会忽略实现方法方面的关键因素，因此导致出现问题。本文将重点强调设置和评估实时荧光定量 PCR 反应时必须考虑的这些因素。
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使用可高压处理的移液器，由于移液器容易受产物气溶胶或标本 DNA 的污染，因此要使用可高压处理的移液器 。严格按照试验的分区进行操作，按照提取区、扩增区、检测区单方向流动，物品、样品和试剂不可逆向流动 。操作多份样品时，制备反应混合液，先将荧光 PCR 反应液、荧光探针和酶混合好，然后分装到每个 PCR 管中，这样即可以减少操作次数，避免污染，又可以增加反应的精确度 。加样品、加蛋白酶 K 和加样品过程中，特别注意防止样品的交叉污染和酶的降解 。操作时设立阴性及阳性对照，可验证荧光 PCR反应的准确性和可信性北京水体基因组荧光定量PCR技术服务
比较Ct值的相对定量法：此方法是将待测靶基因片段和内参照基因片段同时扩增，可以在两个反应管中或者一个反应管中进行扩增反应，并且就两者的ct值之差进行测量。在采用此方法过程中需要用数学公式进行相对量的计算，首先要假设每个循环产物增加一倍时PCR反应**期得到Ct值对起始模板的量一个循环的估算和起始模板数两倍相当。这种方法的前提是靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致，所以在应用过程中效率的偏移会对实际拷贝数估计产生一定影响，因此，为了保证目的基因和内参基因的扩增效率相等应当加强对反应体系的优化，这也是该方法应用的难点之一
自从1983年K. Mullis发明聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)以来，PCR技术很快成为科研、临床诊断的热点技术。
而实时荧光定量PCR技术，顾名思义，就是在PCR的基础上加入荧光基团，通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应过程，***通过对未知模板进行定量分析的方法。
目前，实时荧光定量 PCR 已成为不同样品间进行基因表达水平定量差异比较的**性方法。在过去十几年中，该方法迅速流行，涉及科学的多个领域，包括农业、环境、工业和医学研究。
PCR检测方法在临床医学及实验室检验中**有价值的应用领域就是对***性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR方法就可以检测到。该方法对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，常用于疾病的早期诊断，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。
大量的荧光定量PCR研究资料表明，病原体数量与***性疾病病情的轻重程度、传染性及***效果均有相关性。因此，通过荧光定量PCR方法得到的检测结果，一定程度上可以准确反映疾病***的情况。 天津lncRNA荧光定量PCR技术服务
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混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。 管家基因(β-actin)实时定量PCR
β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
反应体系如下：
标准品反应体系 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 阳性模板上游引物F 0.5μl 3 阳性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 阳性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 北京水体基因组荧光定量PCR检测服务
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