转膜(Transfer)

推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。

通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，江苏长条带Western Blot检测分析服务，需要的转膜时间越长，江苏长条带Western Blot检测分析服务，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，比较好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，江苏长条带Western Blot检测分析服务，通常分子量比较大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 江苏长条带Western Blot检测分析服务

(1) SDS-PAGE凝胶配制 

SDS-PAGE凝胶可以使用商业生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。

(2) 样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 

(3) 上样与电泳：冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，比较好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 江苏长条带Western Blot检测分析服务

Western blotting堪称蛋白质研究中的经典方法。学生物的几乎无人不晓，即使没亲手做过，也清楚其原理。经典果然是经典，30年来其操作步骤几乎没变过，依然是跑胶-转膜-封闭-孵育-检测。近两年，各大公司陆续推出了Western blotting方面的新仪器，如新型转印系统，确实能省时省力不少，但仍然不能完全克服研究人员在面临的挑战。Western

blotting仍存在重复性差、实验耗时长、无法准确定量等问题。

近日，美国proteinsimple公司推出了一种Simple Western™分析，彻底改变了整个Western blot。此分析在一台名为Simon的仪器上开展，Simon将所有实验步骤自动化，包括蛋白上样和分离、免疫印迹、洗涤、检测以及数据的定量分析，让研究人员从繁重的劳动中解放出来，同时避免了可能影响实验重复性的人为因素。

收集蛋白样品(Protein sample preparation)

可以使用适当的裂解液，Western及IP细胞裂解液、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞**白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒

    1.为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。2.电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。3.酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了SDS-PAGE的辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在**中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。 江苏长条带Western Blot检测分析服务

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目前，我国精细化工率在48%左右，与发达地区存在较大的差距，整个销售行业处于成长期，还有很大的发展空间。当前，世界经济复苏步伐艰难缓慢，全球市场需求总体偏弱，国际原油和大宗原料价格低迷，能源发展呈现新的特征。从战略需求看，发展科研技术服务，应用技术服务，科研成果转化，科学产品销售是必然选择。在行业细分领域，我国有限责任公司产业的发展带动化工物流的需求。一方面，化工品大量进出口需要专业化工跨境物流服务商提供服务;一方面我国化工品的生产和消费存在区域不平衡，使得国内化工品运输需求较大。如今，1.发布科研技术 2.发布应用技术 3.发布专业专长 4.发布科研成果 5.发布我的需求 6.发布筛选检验检测服务 7.发布协同代研发服务 8.发布升级改造产品服务 9.发布实验室及仪器设备共享 10.发布培训基地共享 11.发布工厂代加工及共享车间 12.发布科研/项目团队招聘13.发布研究生婚恋 14.发布项目整包服务 15.发布资源交换业务行业纷纷走向规模化、智能化的道路。加上我国的产业政策，从环保的角度、从安全的角度，也要求生产方式从以前传统的单体设备的生产，变成自动化、清洁化的生产装置。江苏长条带Western Blot检测分析服务

上海朝瑞生物科技有限公司致力于化工，是一家服务型公司。公司业务分为科研技术服务，应用技术服务，科研成果转化，科学产品销售等，目前不断进行创新和服务改进，为客户提供良好的产品和服务。公司注重以质量为中心，以服务为理念，秉持诚信为本的理念，打造化工良好品牌。上海朝瑞科技秉承“客户为尊、服务为荣、创意为先、技术为实”的经营理念，全力打造公司的重点竞争力。

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