一、  试剂

1、  淋巴细胞分离液：避光4度保存，用前在37度水浴中加温。整个分离过程中，温度应控制在8-28度，温度过高或过低均影响分离质量。

2、  全培养基（用前配置）：RPM1640培养基，内含20%胎牛血清（Gibco）{56℃灭活30分钟}，1.6-1.8% 1M的HEPES，1，北京SV40法细胞永生化专业定制.2% 0.2mol/L谷氨酰胺，1%青霉素和链霉素。

3、  环胞酶素A（CyA）：5ml(250mg)/瓶，用1640培养基稀释成0.2mg/ml，使用时终浓度为2ug/ml(0.5%)。

4、  EBV液购自中国科学院遗传所，北京SV40法细胞永生化专业定制，储存于零下80度。使用时从冰箱中取出，37度迅速融化，北京SV40法细胞永生化专业定制，用0.22um的滤膜过滤，不要超过0.5-1小时。 北京SV40法细胞永生化专业定制

    实验证明端粒酶的活性与抑*基因表达产物的下调有相关关系，推测抑*基因的失活协同端粒酶的***共同参与细胞永生化进程。目前有多种细胞永生化的方法，但不是每一种方法都可使一个特定的细胞永生化。由于细胞的来源动物、组织不同，其细胞的增殖、分化调控也不尽相同，因此，每类细胞的永生化的分子机制不同，其永生化细胞的方法也不同。优势细胞永生化服务永生化效率高，国际先进技术平台，专业定制，售后保障北京安必奇生物的研究团队在细胞永生化服务方面，拥有多年的研究经验，已经成功建立了多种永生化细胞株，包括人源、鼠源、牛源及犬源细胞。安必奇生物引进其先进的细胞永生化定制平台，依靠多位经验丰富的研究人员，能够为国内科研工作者提供专业的永生化细胞定制服务。您可以提供自主分离的特定原代细胞，也可以从我们的原代细胞产品中选择合适的目的细胞。询价及订购感谢您选择我公司的细胞永生化服务。如有任何相关的问题，请您联系我们的工作人员，我们即刻为您解答和服务。参考文献：庄金秋,梅建国,王文秀,沈志强.细胞永生化技术及其应用研究进展[J].生命科学研究,2011,15(4):363-368.王珊珊,王伟,于莹莹,李辉。北京SV40法细胞永生化专业定制

    HSAS4，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006833大长舌菓蝠肺细胞；DBL1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006834恒河猴肺细胞；RM-L1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006835小鼠肺成纤维细胞；WML2，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006836小鼠胚胎细胞；BABL/C-E，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006837大长舌菓蝠肌肉细胞；DBM1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006838豚鼠肺细胞；GP-F1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006839豚鼠皮肤细胞；GP-S1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006840豚鼠皮肤细胞；GP-S2，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006841豚鼠心肌细胞；GP-H1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006842豚鼠皮肤细胞；GP-S3，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006843叙利亚仓鼠肌肉细胞；GH-M1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006844叙利亚仓鼠皮肤细胞；GH-S1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006845大鼠肺细胞；WTRL1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006846小耳猪肺细胞；SEP-L1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006847小耳猪肺细胞；SEP-L2，规格：>。

细胞永生化(cell immortalization) 指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离, 从而具有无限增殖能力的过程. 自发永生化的几率非常小, 啮齿类动物为10-5~10-6, 而人类细胞则更为罕见, 小于10-12.  通过基因转染等技术将外源性永生化基因, 如、原*基因和抑*基因突变体等, 导入目的细胞内, 以增加永生化的发生率, 进而建立永生化细胞株(immortalized cell strains), 以达到使体外培养的细胞具有无限 增殖能力且细胞间无差异的目的。细胞永生化的研究意义：了解细胞增殖与衰老的分子机制；为研究**、控制肿瘤细胞增殖以及移植等奠定基础；可使传代困难、增殖慢、易衰老的细胞获得永生，获得更多的细胞资源。SV40 Large T （SV40大T抗原）的温度敏感突变株tsA58表达的蛋白在允许温度（permissive temperature）33℃下有活性，在非允许温度（non-permissive temperature）39℃下失活，因而用SV40 Large T (tsA58) 永生化的细胞系具有永生化和温控性双重特性。

    很容易使细胞转化为肿瘤细胞。02端粒酶***端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖**白酶，由RNA和蛋白质组成。端粒酶能以自身的RNA为模板，从端粒DNA3’-OH末端延伸端粒或合成新的端粒DNA，以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短，从而维持端粒的长度，使细胞不会因端粒耗尽而出现凋亡。正常情况下，大多数体细胞端粒酶的表达是严格调控的，表达是瞬时和低水平的。在原代培养的细胞中稳定表达人端粒酶催化亚基(hTERT)基因能稳定端粒的长度，使细胞易于永生化，因此hTERT的***是细胞永生化的重要步骤。虽然***端粒酶活性能够使多种人和动物的细胞永生化，但是对于有些细胞，重建端粒酶活性并不足以使细胞永生化，还需要借助*基因法。03*基因法一些原*基因，如Myc,c-Jun,c-Ias,vsrc和Mdm2，通过基因转染可介导目的细胞永生化。c-Myc是**早被发现的原*基因，有许多与瘤化相关的功能区域，其转录表达的蛋白通过核膜进入细胞核与端粒酶的启动子结合位点特异性结合，诱导端粒酶mRNA快速表达，直接***端粒酶活性，促进细胞进入永生化。细胞永生化过程中，抑*基因如p53,pRb,BRCA1,DPC4等，通过等位基因隐性作用、抑*基因的显性负作用等逐渐失去活性，细胞老化途径受阻。北京SV40法细胞永生化专业定制

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